在進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzyme linked immunosorbent  assay，ELISA）實(shí)驗(yàn)中，有很多需要注意的地方，由于ELISA方法廣泛應(yīng)用在各種抗原和抗體的此定中。但是測(cè)定中的影響因素很多，并且對(duì)操作有較高的要求，所以，在實(shí)驗(yàn)中除了正常的相互反應(yīng)，還會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的反應(yīng)，導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。
而造成這種錯(cuò)誤的可能因素有：標(biāo)本因素；試劑因素；操作因素等。
為此，上海勁馬針對(duì)常見(jiàn)問(wèn)題做分析如下：這里我簡(jiǎn)單的總結(jié)一下：

ELISA 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作要點(diǎn)

無(wú)論在什么研究中，優(yōu)質(zhì)的試劑、良好的和正確的操作是保證ELISA 檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。ELISA  中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的純化水電導(dǎo)率小于1.5μs/cm。

A  標(biāo)本的采取和保存
      大部分ELISA  檢測(cè)均以血清為標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP 為標(biāo)記的ELISA  測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。一般說(shuō)來(lái)，在5  天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致血清IgG  聚合，使間接法的試劑本底加深。超過(guò)一周測(cè)定的需－20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾，澄清后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。
      保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無(wú)菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。
      抗凝不*的標(biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽(yáng)性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。

B  加樣
      加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA  板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。

C  保溫
      在建立ELISA  方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2  小時(shí)，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會(huì)造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應(yīng)，邊上的值會(huì)偏高，建議為了客觀的判斷結(jié)果，將質(zhì)控放在非邊緣位置。

D  洗滌
      洗滌在ELISA 試劑盒過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA  就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)?？梢哉f(shuō)在ELISA  操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。
      洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。
      洗板時(shí)注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋?zhuān)瑧?yīng)按要求稀釋?zhuān)玫乃妼?dǎo)率最好在1.5us/cm  之下，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制。保證洗板浸泡時(shí)間為40  秒左右，孔內(nèi)液體被洗板機(jī)吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。

E  顯色和比色
TMB 經(jīng)HRP 作用后，約40  分鐘顯色隨即逐漸減弱，至2 小時(shí)后即可*消退至無(wú)色。TMB  的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類(lèi)終止劑尚能使藍(lán)色維持較長(zhǎng)時(shí)間（12-24  小時(shí)）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類(lèi)酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)（450nm）測(cè)讀吸光值。酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)儀，通常指專(zhuān)用于測(cè)讀ELISA  結(jié)果吸光度的光度計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線(xiàn)性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在15~30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30  分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。
      測(cè)讀A 值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm  波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀，即每孔先后測(cè)讀兩次，第一次在最適波長(zhǎng)（W1），第二次在不敏感波長(zhǎng)（W2），兩次測(cè)定間不 移動(dòng)ELISA 板的位置，最終測(cè)得的A  值為兩者之差（W1-W2）。雙波長(zhǎng)式測(cè)讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。